DNA甲基化是一种被广泛研究的表观遗传修饰方式，与组蛋白修饰等方式一起，在调控基因表达和染色质构象等方面发挥了重要作用。其中，5-甲基胞嘧啶（5mC）是最重要的DNA甲基化修饰，其广泛存在于植物、动物等真核生物基因组中。5mC能够有效调控基因表达，在疾病的发生发展过程中发挥着关键作用，可作为细胞身份的指纹。因此，科研人员能够分离且仅分离5mC，并且准确、特异地绘制5mC十分重要。

常见的5mC定位分析方法是使用化学品或酶，以不同的方式与5mC及正常未修饰的胞嘧啶发生反应，从而将两者区分开。但传统的亚硫酸氢盐测序（BS-Seq）方法会对DNA造成明显的损害，且难以区分5mC和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。近期开发的其他定位分析方式也存在一定局限性，如需要相对大量的DNA样本等。

为了克服上述难点，美国宾夕法尼亚大学的研究团队在国际期刊Nature Chemical Biology上发表了题为“Direct enzymatic sequencing of 5-methylcytosine at single-base resolution”的文章。研究团队开发了一种仅使用酶的DNA甲基化测序新方法——“直接甲基化测序（DM-Seq）”，其灵敏度较高、不会损害样本；仅使用稀少的DNA样本就可以单碱基分辨率对5mC进行分析，有望应用于液体活检和早期癌症检测等。与现有方法不同，该方法可以准确、清楚地识别5mC，而不会与其他常见甲基化修饰混淆。

文章发表在Nature Chemical Biology

DM-seq的开发和应用

DM-Seq采用了两种关键的DNA修饰酶：一种经设计的DNA甲基转移酶以及一种DNA脱氨酶，这两种酶结合使用，能够精确区分胞嘧啶修饰状态。将上述酶活性与脱氨酶抗性适配体器耦合，可以在测序中通过C-to-T转换精确、特异性地检测出5mC。DM-Seq敏感性较高，通过纳克级数量的DNA即可进行检测，有望应用于血液检测，例如寻找从肿瘤或其他病变组织释放到血液中的DNA。

具体而言，为克服5hmC和5mC混淆的问题，研究团队使用工程化改造的酶CxMTase和工程化改造的底物CxSAM与DNA脱氨酶APOBEC3A（A3A）搭配使用，CxMTase将胞嘧啶C修饰为3cxmC，可有效抵御A3A的脱氨作用（图1c）。至此，研究团队完成了DM-seq的设计和开发，其可直接在基因组中单独测序5mC。

图1. DM-seq的原理示意图

DM-Seq在单碱基分辨率下准确检测CpG，灵敏度更高

研究团队将DM-Seq与传统甲基化测序方法进行了比较（图2）。结果显示，与BS-Seq相比，DM-Seq可以检测更为痕量的核酸样品，两种方法所需检测样本量相差22倍。在全基因组水平上，经不同处理后，在不使用甲基转移酶的条件下，BS-Seq的CpG不转化率较低（0.23%），DM-Seq脱氨保护率较高（96.7%），表明DM-Seq能够以单碱基分辨率准确检测CpG。此外，相关性分析显示，DM-Seq和BS-Seq具有很强的相关性。

研究团队还将DM-Seq与新兴的5mC测序技术TAPS进行了比较。结果显示，TAPS有一个先前未被发现的缺点，或会降低其检测5mC的灵敏度。

图2. DM-Seq以单碱基分辨率准确检测5mCpG

DM-Seq在表征人类肿瘤方面优于BS-Seq

研究团队从经手术切除的胶质母细胞瘤（GBM）患者中提取了样本，并分别进行了DM-Seq和BS-Seq测序（图3）。结果显示，与BS-Seq相比，DM-Seq捕获的1kb非重叠独特bin至少增加了5.9倍，这表明DM-Seq能够更好地区分基因组关键位上的5mC和5hmC，并且可通过甲基化水平来预测患者的结局。

接下来，研究团队进一步探讨了BS-Seq（5mC+5hmC）和DM-Seq（仅5mC）两个数据集之间的相关性。结果显示，BS-Seq和DM-Seq数据集的信号之间存在较强的负相关，但在各种基因组元件中，基于这两种方法生成的图谱总体相似。此外，在GBM相关的CpG位点中，DM-Seq报告了61.4%的5mC修饰，与BS-Seq相比低14.3%，表明其可量化具有功能重要性CpG上的5hmC“盲点”（图3e）。

最后，研究团队随机抽取了1485个CpG位点进行验证，发现75.6%的检测值在BS-Seq的预期范围内，但高于DM-Seq检测范围的CpG位点是主要异常值。上述结果表明，与BS-Seq相比，通过DM-Seq直接检测5mC能够揭示临床肿瘤样本中具有预后意义的CpG。 

图3. DM-Seq直接检测GBM中的5mCpG

结语

综上所述，研究团队设计了一种全酶、无损、可靠和直接的方法“DM-Seq”来单独检测5mC，解决了传统方法中5mC和5hmC混淆、难以区分的局限。该方法灵敏度较高，可应用其分析极少量的DNA样本，例如用于早期癌症检测的无细胞DNA，这为部分癌症患者的诊断和预后判断提供了潜在可行的方案。该研究揭示，通过DM-Seq直接检测5mC能够推进使用表观遗传测序改善患者护理预后的发展。

参考文献：

Wang, T., Fowler, J.M., Liu, L.et al. Direct enzymatic sequencing of 5-methylcytosine at single-base resolution. Nat Chem Biol (2023). https://doi.org/10.1038/s41589-023-01318-1.

https://medicalxpress.com/news/2023-06-precise-efficient-dna-sequencing-method.html.