嗅外间充质干细胞（OE-MSC）是来源于鼻粘膜固有层的间充质干细胞，具有神经源性和免疫调节特性，并被证明可以在脊髓创伤、听力损失、帕金森病、健忘症和周围神经损伤的动物模型中诱导恢复。作为迈向临床实践的一步，作者旨在设计满足人类健康机构规定要求的培养方案，以及评估干细胞对神经元分化的功效。

嗅鞘细胞是MSC的一个亚型，起源于神经嵴，位于面部，可以分化为外胚层和中胚层细胞类型，OE-MSCs 属于神经组织，参与终生发生在嗅粘膜中的永久性神经发生。该文章主要描述了一种安全高效制备嗅鞘细胞的方法，为临床治疗提供细胞药物。

酶消化更快的裂解细胞

普通培养需要24天才能达到560万个细胞，而酶消化技术仅需21天培养即可提供近800万个细胞。两种酶EDTA和TrypleE之间没有显著差异，都可以完全解离细胞，存活率超过99%。

图1 两种纯化方法对 OE-MSCs 增殖的影响

人血小板裂解物代替胎牛血清

与血清相比，血小板裂解物（v/v，10%）诱导更强的细胞增殖：对于两种血小板裂解物，倍数变化分别为 3.1 和 4.1（图 2A）。为了确定血小板裂解物对细胞增殖最有效的浓度，作者使用来自三个供体的干细胞评估了 PL100 对增殖的影响。图2C表明加倍时间往往会随着血小板裂解物的增加而减少。然而，在任何浓度下均未观察到统计学上的显着差异。图 3D所示，裂解物灭菌后细胞增殖保持稳定。

图2 培养条件对细胞增殖的比较

纯化的细胞表达嗅鞘细胞公认标志物

OE-MSC对 CD31、CD34 和CD45（造血干细胞的识别标志物）呈阴性，对 CD90 和 CD146（嗅觉干细胞的表面标志物）呈阳性（图 3A ）。此外，OE-MSCs 表达的S100A4，被称为这种特定细胞类型的细胞内标记。

然而，为了确保培养物中细胞类型为单一的嗅鞘细胞，避免出现成纤维细胞，成纤维细胞是一种存在于固有层中并产生上述蛋白质的细胞类型，作者评估了 NESTIN 的表达。数据显示， 只有OE-MSC 表达NESTIN。

图3 嗅鞘细胞表型特征

临床级嗅鞘细胞条件培养基促进神经元分化

当用 24小时或48小时OE-MSC 条件培养基孵育3天时，N2a 细胞倾向于分化为神经元。与使用增殖或分化培养基培养的N2a细胞相比，24小时OE-MSC 条件培养基或 48 小时分化细胞的比例在第 1 天显着增加。培养3天后，在第 1 天（24 小时）和第2天（48 小时）收集的条件培养基培养的 N2a 的分化细胞比例显着增加。与第3天的分化培养基相比，两种条件培养基（24 小时）都改善了N2a细胞的分化，但只有 48 小时条件培养基的增加具有统计学意义。

讨论

本文章描述了一种更安全、更高效的临床级嗅觉干细胞制造工艺。

基于研究性医药产品的临床试验要求，需要制造符合“特定于高级治疗药品的良好生产规范指南”的细胞产品。为了满足这些要求，生产制作细胞产品应用了一些修改。首先，所有培养物均在当地公立医院 (AP-HM) 的细胞治疗实验室进行，该实验室获得法国国家药品安全机构 (EudraGMDP n°TIE/20/O/001) 的生产ATMP授权. 该机构经理的定期访问使维持这种高水平的要求成为可能。培养方案的各个步骤被修改为 (i) 抑制异种产品的使用，(ii) 简化程序和 (iii) 简化 GMP 要求的实现。

研究结果显示，与 24小时 OE-MSC条件培养基相比，48 小时的培养基含有更多有利于周围神经再生的细胞因子、生长因子和神经营养因子。作者证明仅48小时 OE-MSC条件培养基会对N2a的神经元分化产生统计学上的显着影响。该结果可能与 OE-MSC 释放的分子质量有关。其他研究报道称，在 OE-MSC 的条件培养基中，高浓度因子（例如 MCP-1、IL-1、IL-10、VEGF）在雪旺细胞的再生过程和作用中发挥着核心作用。

OE-MSCs 的潜在治疗益处也在影响周围或中枢神经系统的各种损伤/病理的动物模型中进行了测试。在复制阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症、小脑性共济失调、缺血性中风、脊髓损伤等疾病模型中进行了效果验证。其作用机制涉及分泌营养因子，调节炎症反应，吞噬细胞包涵体或有害分子，调节氧化应激等。

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