癌症的治疗效果和生存时间与癌症发现的早晚密切相关，因此癌症的早期检测尤为重要。目前临床癌症早期筛查方法的实施仍然具有挑战性。例如，虽然LDCT筛查已被证明可以降低死亡率，但在高危人群中坚持使用该检测的比例较低，部分原因是其低特异性、辐射暴露和过度诊断等引起的潜在危害。此外，对于部分癌症类型，虽然早期发现可以改善患者的预后，但目前仍未找到有效的筛查模式。

液体活检可能克服上述挑战，通过检测细胞游离DNA（cfDNA）中的循环肿瘤DNA（ctDNA）来检测癌症。但在癌症基因组中，cfDNA携带突变信息比例通常很低，这使得在序列的背景噪声中很难检测出真正的突变信息。

近日，美国约翰霍普金斯大学医学院等单位的研究团队在Nature Genetics发表了题为“Single-molecule genome-wide mutation profiles of cell-free DNA for non-invasive detection of cancer”的文章。

研究团队开发了一种利用单分子测序识别cfDNA中大量体细胞突变的方法，称为GEMINI（GEnome-wide Mutational Incidence for Non-Invasive detection of cancer）。研究团队利用GEMINI发现了癌症患者的组织和cfDNA中不同区域的突变类型特异性频率，这些频率与复制时间和其他染色质特征相关，同时GEMINI发现的全基因组突变谱结合其他特征以及一种机器学习模型能够检测到超过90%的肺癌患者，包括I期和II期患者。因此，GEMINI方法为使用全基因组突变特征进行非侵入性癌症检测奠定了基础，这可能有助于癌症筛查和治疗监测。

文章发表在Nature Genetics

主要研究内容

体细胞突变可用于非侵入性癌症诊断

为应对早期癌症检测所面临的挑战，研究团队开发了GEMINI方法。GEMINI通过对cfDNA进行单分子测序，以估计全基因组范围内的突变频率和突变类型。对每个个体而言，将癌症中更易发生突变基因组区域的突变类型和频率，与正常cfDNA中更易发生突变区域的基因图谱进行比较，可确定突变图谱的多区域差异。通过这种方式，GEMINI富集了可能的体细胞突变，同时在全基因组范围内考虑了个体的可变性。

具体来讲，GEMINI检测旨在寻找整个基因组中的DNA突变。首先，从有患癌症风险的个体采集血液样本，提取cfDNA并进行低成本的全基因组测序，分析DNA的单分子序列变化，以用于获得整个基因组的突变概况。最后，利用一个经过训练的机器学习模型用于识别基因组不同区域中癌症和非癌症突变频率的变化，以区分癌症患者和非癌症患者。

图1. cfDNA单分子测序检测方案示意图

为了开发GEMINI，研究人员检查了来自全基因组泛癌症分析（PCAWG）中25种不同癌症的2511名个体的癌症全基因组序列，确定了不同肿瘤类型的基因组中不同的突变频率。例如，肺癌平均每个基因组有52209个体细胞突变。为检测全基因组突变频率的变化，研究团队分析了31个PCAWG匹配样本，将包含3,076,901个突变的序列数据放入1,144个不重叠的2.5Mb bins中，发现许多肿瘤的全基因组共享突变频率增加的区域。

为了评估GEMINI对肿瘤来源DNA的检测，研究人员在一组癌症和对照组训练集中确定了C>A突变最高的基因组区域，在31例PCAWG中发现了C>A变化富集的区域，但在正常样本中没有发现，表明在给定患者样本中，减去癌症和对照区域之间的突变频率将有助于去除背景突变。使用C>A区域频率，GEMINI区分癌症与非癌症样本具有较高的准确性，AUC为0.91。

图2. PCAWG肺癌及正常样本的单分子突变分析

cfDNA中的癌症类型特异性突变谱

接下来，研究团队评估了GEMINI检测前瞻性肺癌诊断队列（LUCAS）个体cfDNA突变的能力，分析了该队列中365名受试者的低覆盖血浆全基因组数据（WGS） 。

结果显示，在肺癌、黑色素瘤和B细胞非霍奇金淋巴瘤患者的肿瘤组织和cfDNA中，具有高突变频率的基因组区域在很大程度上相似，并且位于与组织特异性晚期复制时间相关的基因组区域。同时，肿瘤和突变类型特异性的区域突变频率与基因表达、甲基化特征载体分析测量的基因组分区、以及异染色质标记H3K9me3有关。没有癌症或突变类型或癌症不富集区域的个体不具有这些特征，或与这些特征之间仅存在弱相关性。以上结果表明，cfDNA全基因组突变率与染色质组织有关，GEMINI可以利用这一特征检测ctDNA。

图3. 组织和血浆样本的全基因组突变谱分析

GEMINI和DELFI结合可改善肺癌的检测

研究团队还分析了GEMINI能否与DELFI联合使用，DELFI是一种检测基因组中cfDNA片段大小和分布变化的方法，以改善早期肺癌的检测。虽然GEMINI和DELFI得分正相关，但联合方法有更高的整体表现。对于I期患者（n = 13），单独DELFI或GEMINI患者的AUC分别为0.73和0.80，联合使用时的AUC为0.87。组合方法总体敏感性为91%，特异性为80%。此外，GEMINI--DELFI模型交叉验证结果表明，全基因组突变图谱可用于高危人群早期肺癌的检测。

图4. 使用GEMINI和GEMINI--DELFI联合方法检测肺癌

GEMINI检测癌症的广泛性

除肺癌外，研究团队还研究了GEMINI在其他癌症中的应用，包括7名在采血时没有任何可检测肿瘤的患者，其中6例GEMINI得分较高，并在获得样本后的231天至1868天内被诊断为肺癌，表明cfDNA突变谱的异常可以在标准诊断前数月即检测到癌症的发生。

数据表明，GEMINI可以区分肺癌的亚型，并可以检测早期肝癌。在一组接受肺癌药物治疗的患者中，GEMINI评分在治疗的初始反应期间下降，表明该检测可用于监测治疗期间的患者。

图5. GEMINI方法用于多种癌症类型的非侵入性检测

结 语 

综上所述，研究团队发现通过cfDNA低覆盖率WGS获得的单分子突变谱可以用于癌症的无创检测。GEMINI方法不需要对匹配的血细胞进行深度测序，也不需要对肿瘤进行测序以识别血浆中的肿瘤特异性突变，因此适用于癌症的从头检测和表征。GEMINI涉及从cfDNA中构建单个基因组文库，与基于更复杂的方法相比，可以提供更多的信息。此外，GEMINI和DELFI片段分析方法的结合还可能为成本效益高和可扩展的癌症检测提供机会。

文章通讯作者、约翰霍普金斯大学医学院Victor Velculescu教授表示：“该研究首次表明，像GEMINI这样结合cfDNA单分子全基因组突变谱的检测，与其他癌症检测方法相结合，可用于癌症的早期检测，以及在治疗期间监测患者。”

文章第一作者、约翰霍普金斯大学医学院Daniel Bruhm博士表示：“这项研究主要集中在高风险人群肺癌的检测上，不过我们在其他癌症，包括肝癌、黑色素瘤或淋巴瘤的患者身上也发现了cfDNA突变谱的改变，这表明该方法可以更广泛地应用。”

参考文献：

1. Daniel Bruhm et al, Single-molecule genome-wide mutation profiles of cell-free DNA for non-invasive detection of cancer, Nature Genetics (2023). https://www.nature.com/articles/s41588-023-01446-3

2. Sung, H. et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 71, 209–249 (2021).

3. The ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature 578, 82–93 (2020).