摘要:目的探索急性颈动脉血栓性闭塞(ACTO)形成后,血栓动态演变过程中巨噬细胞的浸润行为变化｡方法选用健康雄性新西兰大白兔15只,通过使用氯化铁处理后的外科缝合线对兔颈动脉造成损伤来建立ACTO模型｡采用随机数字表法将所有兔按照实验终点时间分为5组;术后24h组及术后1､4､8､12周组,每组3只｡术后24h,使用DSA检查ACTO模型建立情况｡到达实验时间终点时对该组3只兔进行血栓栓塞段动脉取材并用石蜡包埋｡采用苏木素-伊红(HE)染色和马休黄猩红蓝(MSB)对血栓样本进行染色,分析血栓形态和血栓组成(包括红细胞､纤维蛋白和胶原纤维)的变化,使用Orbit Imaging Analysis软件对血栓组成成分进行半定量分析｡使用免疫组织化学对血栓中M0和M2型巨噬细胞的分布进行检测,依据检测结果总结ACTO发生后不同时期血栓的形态､组成及血栓中巨噬细胞浸润行为的动态演变规律｡结果术后24hDSA结果显示,所有的实验兔均成功建立了ACTO模型｡(1)HE染色结果显示,在术后24h至1周的时间段内,血栓呈持续增大趋势;术后4周时,血栓开始出现溶解现象;术后8周时,血栓内部观察到了新生血管的形成;而术后12周时,血栓开始呈现出纤维化的迹象｡(2)MSB染色结果显示,在血栓形成的急性期(术后24h内),红细胞为主要成分;在此之后,以纤维蛋白和胶原纤维为主要成分｡(3)M0型巨噬细胞(细胞表面标志物为CD206)检测结果显示,术后24h,血栓中M0型巨噬细胞并未均匀分布于整个血栓中,而主要聚集于血栓边缘;术后1周时,血栓内M0型巨噬细胞阳性面积百分比相较于术后24h增加[血栓边缘:(41.7±27.0)%比(24.6±16.7)%,血栓核心:(35.7±19.6)%比(11.1±10.4)%,均P<0.001],且均匀分布于血栓内;术后4周时,血栓内M0型巨噬细胞的阳性面积百分比相较于术后1周减少[血栓边缘:(10.7±6.1)%比(41.7±27.0)%,血栓核心:(12.1±8.5)%比(35.7±19.6)%,均P<0.001],差异均有统计学意义｡术后4､8､12周,血栓内M0型巨噬细胞阳性面积百分比随时间延长无明显变化[血栓边缘的阳性面积百分比分别为(10.7±6.1)%､(8.0±7.7)%､(8.9±5.3)%;血栓核心的阳性面积百分比分别为(12.1±8.5)%､(9.5±4.2)%､(15.7±11.0)%],差异均无统计学意义(均P>0.05)｡此外,术后12周血栓边缘M0型巨噬细胞的阳性面积百分比少于血栓核心处[(8.9±5.3)%比(15.7±11.0)%,P<0.01)]｡M2型巨噬细胞(细胞表面标志物为CD206)检测结果显示,术后24h,血栓中M2型巨噬细胞广泛分布于整个血栓内;术后1周时,血栓内M2型巨噬细胞的阳性面积百分比相较于术后24h增加[血栓边缘:(22.1±11.3)%比(11.4±8.7)%,P<0.001;血栓核心:(24.5±9.8)%比(7.6±6.0)%,P<0.001];术后4周,血栓内M2型巨噬细胞阳性面积百分比相较于术后1周减少[血栓边缘:(10.6±3.7)%比(22.1±11.3)%,P<0.001;血栓核心:(9.2±4.3)%比(24.5±9.8)%, P<0.001];术后8周血栓核心处M2型巨噬细胞的阳性面积百分比相较于术后4周时又增加[(17.9±8.8)%比(9.2±4.3)%, P<0.001],差异均有统计学意义｡而术后8周至12周血栓内M2巨噬细胞的阳性面积百分比无明显变化[血栓边缘:(9.4±6.3)%比(8.5±5.3)%,P>0.05;血栓核心:(17.9±8.8)%比(14.4±10.0)%,P>0.05]｡此外,术后8､12周时血栓核心M2型巨噬细胞阳性面积百分比均多于血栓边缘处[术后8周:(17.9±8.8)%比(9.4±6.3)%, P<0.001;术后12周:(14.4±10.0)%比(8.5±5.3)%,P<0.001]｡结论本研究成功构建了ACTO动物模型,首次展示了血栓形成后12周内巨噬细胞的动态演变规律｡巨噬细胞在血栓形成和血栓纤维化过程中发挥着重要作用,并可能促进了血栓溶解和血栓内新生血管形成,进而促进闭塞血管自发再灌注的发生｡本研究结果有待进一步验证｡

急性颈动脉血栓性闭塞(acute carotid thrombosis,ACTO)是导致缺血性卒中的重要原因之一｡ACTO形成的危险因素包括斑块破裂､血管损伤､凝血异常和血管炎症等,主要治疗方式为静脉溶栓和机械取栓,其治疗时间窗分别为发病后6h以内和24h以内｡然而,由于对疾病的认知不足､转运时间延迟和医疗资源分布不均等因素,部分患者难以及时接受治疗｡据统计,中国静脉溶栓治疗率仅为3.20%~5.20%,机械取栓治疗率更低,仅为1.45%｡因此,深入研究ACTO形成后血栓长期动态演变,对于拓宽治疗时间窗,改进血栓治疗方法,改善患者临床结局至关重要｡由于受机械取栓治疗时间窗的限制,当前对ACTO的研究主要集中在血栓形成4周以内,对于形成时间超过4周的血栓的研究报道较少｡这极大地限制了对缺血性卒中术后延迟再通和自发再灌注具体机制的进一步了解,尤其是限制了超时间窗就诊患者治疗方案的改进及其个性化治疗方案的制定｡

巨噬细胞在组织修复､再生和纤维化过程中扮演着重要的调节角色,其表型和功能的显著变化受到局部炎症微环境释放的趋化因子和细胞因子的调控｡研究表明,血栓内巨噬细胞通过多种方式促进了血栓的溶解和新生血管的生成,其中包括清除细胞碎片､分泌基质金属蛋白酶和尿激酶,以及释放生长因子和趋化因子｡巨噬细胞浸润行为被认为与ACTO患者发病后超24h出现的自发性再灌注和延迟再通有关。然而,巨噬细胞在血栓中的浸润行为机制尚未完全阐明｡因此,本研究拟通过建立ACTO兔模型,并结合组织病理学和免疫组织化学染色方法,系统分析ACTO动态演变过程中的组织成分变化和巨噬细胞的浸润行为,为进一步完善血栓形成后的长期演变机制提供参考｡

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用5~6月龄新西兰大白兔15只,雄性,体质量2.5~3.5kg,平均(3.0±0.5)kg｡由国家心血管病中心华中分中心动物实验中心统一购买[动物合格证号:SCXK(豫)2019-002]｡所有实验操作开始之前,对兔子进行麻醉,即静脉注射舒泰-50(5~10mg/kg)诱导麻醉,然后通过面罩吸入浓度为1%~2%的七氟烷和1.5~2.0L/min的氧气来维持麻醉,并在整个麻醉过程中对生命体征进行持续监测｡本研究方案经过国家心血管病中心华中分中心实验动物管理与使用委员会批准(伦理批号:2024006)｡所有实验动物由专业人员在室温28℃及适宜湿度条件下饲养｡

1.2 药品､试剂及仪器

苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(批号:C0105S,上海碧云天生物技术股份有限公司),改良的马休黄猩红蓝(Martius scarlet blue,MSB)染色试剂盒(批号:G2040,北京索莱宝科技有限公司),免疫组织化学试剂盒,包括过氧化氢酶阻断溶液､反应增强液､增强酶标山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G聚合物(批号:PV-9000,北京中杉金桥生物技术有限公司),二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)辣根过氧化物酶显色试剂盒(批号:P0202,上海碧云天生物技术股份有限公司)｡三羟甲基氨基甲烷—乙二胺四乙酸抗原修复液(批号:C1037,北京索莱宝科技有限公司),磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS;批号:P1020,北京索莱宝科技有限公司),封闭山羊血清(批号:SL038,北京索莱宝科技有限公司),氯化铁溶液(批号:I433834,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)｡一抗:抗CD68抗体(1∶3000;Abcam,Cat.No.ab955)､抗CD206抗体(1∶2000; Proteintech, Cat.No.18704-1-AP)｡舒泰-50(主要成分:替来他明125mg+唑拉西泮125mg;法国维克),布托啡诺(美国默沙东制药),七氟烷(山东鲁南贝特),盐酸利多卡因(重庆方通动物药业),3-0､5-0外科缝合线(上海金环),动脉夹(上海金钟)｡数字减影血管造影机(型号:IGS330,通用公司,美国),动物麻醉机(型号:R620-S1-SECP,瑞沃德公司,中国),显微镜(型号:OM40561,奥林巴斯株式会社,日本)｡

1.3 建模和动物分组

1.3.1兔ACTO模型建立方法:本研究通过模拟血栓形成的3大危险因素来建立兔ACTO模型:(1)牵拉缝合线损伤血管内皮,造成内皮损伤;(2)从血管正中缝合血管造成局部狭窄,改变血流动力学;(3)参考Neeves提出的方法:氯化铁溶液中Fe3+和Cl-与血液发生制絮反应,可增加血液凝固性｡血栓形成原理见图1｡具体操作为:将兔全身麻醉后备皮,沿兔颈部正中切开,充分暴露出约2cm长的颈动脉并用动脉夹固定出损伤部位;然后将浸泡于20%的氯化铁溶液中3h的4-0外科缝合线穿入血管内长约1cm,左右牵拉3次损伤血管内皮细胞,接着使用5-0可吸收缝合线垂直血管长轴进行缝合,造成血管管腔50%狭窄,随后松开动脉夹并进行压迫止血,逐层缝合切口｡

1.3.2实验动物分组:所有动物均采用上述方法造模,术后采用随机数字表法将新西兰大白兔分为5组:术后24h组､术后1周组､术后4周组､术后8周组和术后12周组,每组各3只｡术后正常喂养直至实验终点时间｡

1.3.3影像学评估:术后24h,麻醉后沿腹股沟韧带处纵性切开皮肤及皮下组织,充分暴露出股动脉,用桡动脉穿刺针斜插入股动脉置入5F动脉导管鞘管(日本泰尔茂);经动脉鞘将5FNavion造影导管(美国Medtronic)及泥鳅导丝(日本泰尔茂)送至股动脉中部位置,利用同轴传送系统技术将造影导管和导丝送至主动脉弓,撤出泥鳅导丝对兔颈动脉进行DSA检查｡DSA影像显示造模侧颈动脉闭塞(无血流通过)则说明模型建立成功,否则表示模型建立失败｡

1.4 HE及MSB染色

各组兔模型在实验终点时间到达后,通过静脉注射5~10ml的25%的氯化钾溶液将兔处死｡由于血栓碎片可能会在取出过程中丢失,不能反映整个闭塞段的血栓特性,并且血栓的形态及形状可能会因取出技术而改变,所以本研究将造模侧颈动脉分离后,先将血栓栓塞段的近心和远心端进行结扎､再剪取血栓栓塞段血管,用等渗盐水清洗3次,浸泡于4%多聚甲醛固定保存｡取固定好的血管组织进行常规的石蜡包埋,将包埋好的样本按血管圆环状进行切片｡取石蜡切片进行HE和MSB染色,于光学显微镜下观察组织病理变化并拍照留图｡为计算血栓中各构成成分的含量,使用Orbit Imaging Analysis(version5.4.x,Idorsia Pharmaceuticals)软件对样本的MSB染色图像进行半定量分析,计算纤维蛋白(红色或蓝色)､红细胞(黄色)､胶原纤维(蓝色)在整个血栓中所占比例｡其中颜色均以网状结构分布的蓝色组识为胶原纤维,颜色深浅不一,成团存在的蓝色组织则为纤维蛋白｡

1.5 免疫组织化学染色

为了评估血栓内巨噬细胞[M0型巨噬细胞(细胞表面标志物为CD68)和M2型巨噬细胞(细胞表面标志物为CD206)]的浸润情况,对血栓组织进行免疫组织化学染色｡使用抗CD68抗体标记M0型巨噬细胞､抗CD206抗体标记M2型巨噬细胞｡采用免疫组织化学PV-9000法｡组织切片经常规脱蜡､水化后,用三羟甲基氨基甲烷—乙二胺四乙酸抗原修复液100℃修复20min,自然冷却至室温｡使用PBS在摇床上洗3次,每次3min｡滴加试剂盒内过氧化氢酶阻断溶液,室温下孵育10min｡用PBS在摇床上洗3次,每次3min｡滴加封闭山羊血清,室温孵育20min,倾去｡滴加稀释后的抗CD68抗体和抗CD206抗体,37℃孵育1h｡用PBS在摇床上洗3次,每次3min｡滴加反应增强液,室温下孵育10min｡用PBS在摇床上洗3次,每次3min｡滴加试剂盒内增强酶标山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G聚合物,37℃孵育20min｡用PBS在摇床上洗3次,每次3min｡滴加过氧化物酶显色液,室温孵育10min｡自来水冲洗后,单纯苏木素复染细胞核,自来水冲洗10min,95%乙醇冲洗30s,无水乙醇冲洗1min,干燥,二甲苯透明3min,中性树胶封片｡晾干后,显微镜观察｡使用计算机图像处理软件Image-Pro Plus6.0确定(免疫)阳性区域(视野内的淡黄色或棕黄色区域),并计算阳性面积百分比(视野内阳性面积/视野面积×100%)｡为了对血栓内巨噬细胞数量进行分析,在所有动物组织样本的远心端､中间和近心端各取一张切片进行染色,并在每张切片的血栓边缘和血栓核心区域分别随机选定3个视野(于40倍镜下)评估巨噬细胞阳性面积百分比,并计算3个视野所观察到的阳性面积百分比的平均值｡

1.6 统计学分析

使用GraphPad Prism9统计软件对所有数据进行统计学分析｡采用Shapiro-Wilk方法对数据进行正态性检验,符合正态分布的计量资料以x-±s表示,组间比较采用一元方差分析(one-way ANOVA),进一步进行两两比较采用Turkey HSD检验;不同部位的巨噬细胞阳性面积百分比的比较采用t检验｡以P<0.05为差异有统计学意义｡

2 结果

2.1 兔ACTO模型建立结果

术后24h DSA检查结果表明,所有动物均发生了急性颈动脉闭塞,成功建立了兔ACTO模型｡典型ACTO模型DSA图像见图2｡此外,在整个实验期间,所有动物均无意外死亡,且生存状态良好｡

2.2 HE及MSB染色结果

兔ACTO模型颈动脉闭塞段血栓组织的病理染色结果如图3所示｡术后24h,血管内血栓形成,除缝合线牵拉处存在局部空隙外,血管内大部分区域被血栓组织所填充(图3-A1),血栓内有大量红细胞,其间可见纤维蛋白网及少量胶原纤维(图3-A2)｡术后1周,血栓体积较术后24h更为致密(图3-B1),且与术后24h比较,血栓内红细胞大量消退､纤维蛋白含量明显增加(图3-B2);术后4周,血管内闭塞性血栓完全机化,其内部炎症消退,肉芽组织完全替代血栓,血栓出现局部溶解而形成孔隙(图3-C1);血栓内主要由少量红细胞及大量纤维蛋白和胶原纤维构成(图3-C2)｡术后8周,血管内血栓持续溶解,孔隙开始内皮化并形成新生血管(图3-D1),血栓内胶原纤维呈网状结构(图3-D2);术后12周,闭塞性血栓完全纤维化,血栓收缩使其结构更为稳固(图3-E1),血栓内纤维蛋白和胶原纤维占据血栓绝大部分(图3-E2)｡

2.3 血栓组织成分的MSB染色图像的半定量分析结果

术后24h组血栓内红细胞占73.0%,术后1周时迅速减少至37.0%,术后4周时剩余8.0%,术后8周和12周时血栓中红细胞持续消退,术后8周占3.0%､术后12周占1.2%｡血栓中纤维蛋白在血栓形成后持续增加,术后24h组血栓中新鲜纤维蛋白占比为18.0%,术后1周时迅速增加至38.0%,术后4周时达到54.0%,术后8周时为56.0%,术后12周时达到62.0%｡术后24h及1周时,血栓中的胶原纤维分别为9.0%､25.0%,术后4周时血栓内胶原纤维占比增加至38.0%,术后8周时达到41.0%,术后12周时约占血栓组成的36.8%｡见图4｡

2.4 血栓免疫组织化学染色结果

M0型巨噬细胞(细胞表面标志物为CD68)检测结果显示,血栓边缘及血栓核心的M0型巨噬细胞在不同时间点的阳性面积百分比组间比较差异均有统计学意义(血栓边缘:F=4.345,P=0.004;血栓核心:F=6.55,P<0.001)｡术后24h,血栓中M0型巨噬细胞并未均匀分布于整个血栓中,而主要聚集于血栓边缘;术后1周时,血栓内M0型巨噬细胞阳性面积百分比相较于术后24h显著增加[血栓边缘:(41.7±27.0)%比(24.6±16.7)%,血栓核心:(35.7±19.6)%比(11.1±10.4)%,均P<0.001],且均匀分布于血栓内;术后4周时,血栓内M0型巨噬细胞的阳性面积百分比相较于术后1周显著减少[血栓边缘:(10.7±6.1)%比(41.7±27.0)%,血栓核心:(12.1±8.5)%比(35.7±19.6)%,均P<0.001],差异均有统计学意义｡术后4､8､12周,血栓内M0型巨噬细胞阳性面积百分比随时间延长无明显变化[血栓边缘的阳性面积百分比分别为(10.7±6.1)%､(8.0±7.7)%､(8.9±5.3)%;血栓核心的阳性面积百分比分别为(12.1±8.5)%､(9.5±4.2)%､(15.7±11.0)%,差异均无统计学意义(均P>0.05);此外,术后12周血栓边缘M0型巨噬细胞的阳性面积百分比少于血栓核心处[(8.9±5.3)%比(15.7±11.0)%,P<0.01]｡见表1,图5｡

M2型巨噬细胞(细胞表面标志物为CD206)检测结果显示,血栓边缘及血栓核心的M2型巨噬细胞在不同时间点的阳性面积百分比组间比较差异均有统计学意义(血栓边缘:F=10.34,P<0.001;血栓核心:F=2.35,P=0.060)｡术后24h,血栓中M2型巨噬细胞广泛分布于整个血栓内;术后1周时,血栓内M2型巨噬细胞的阳性面积百分比相较于术后24h增加[血栓边缘:(22.11±11.3)%比(11.4±8.7)%,P<0.001;血栓核心:(24.5±9.8)%比(7.6±6.0)%,P<0.001];术后4周,血栓内M2型巨噬细胞阳性面积百分比相较于术后1周减少[血栓边缘:(10.6±3.7)%比(22.1±11.3)%, P<0.001;血栓核心:(9.2±4.3)%比(24.5±9.5)%, P<0.001];术后8周血栓核心处M2型巨噬细胞的阳性面积百分比相较于术后4周时增加[(17.9±8.8)%比(9.2±4.3)%,P<0.001],差异均有统计学意义｡而术后8周至12周血栓内M2型巨噬细胞的阳性面积百分比无明显变化[血栓边缘:(9.4±6.3)%比(8.5±5.3)%, P>0.05;血栓核心:(17.9±8.8)%比(14.4±10.0)%, P>0.05)]｡此外,术后8､12周时血栓核心巨噬细胞的阳性面积百分比均多于血栓边缘处[术后8周:(17.9±8.8)%比(9.4±6.3)%,P<0.001;术后12周:(14.4±10.0)%比(8.5±5.3)%, P<0.001)]｡见表2,图6｡

3 讨论

ACTO可导致颈动脉血流中断甚至阻断脑部供血,从而引发缺血性卒中,使患者出现运动障碍和昏迷等严重并发症｡在本研究中,我们通过模拟血栓形成的3大危险因素建立ACTO动物模型并对闭塞段血管的血栓组织进行组织病理学分析,首次总结了兔ACTO形成后12周内血栓形态､血栓组成和巨噬细胞浸润行为的动态演变规律｡

本研究结果显示,术后1周血栓增长至最大且致密,血栓内巨噬细胞数量也最多,而Nosaka等的研究中通过对造模后不同时间段的深静脉血栓模型的血栓组织进行巨噬细胞免疫组织化学染色并对血栓内巨噬细胞数量进行半定量分析,结果显示,术后1周血栓内巨噬细胞数量最多｡这表明动､静脉血栓中巨噬细胞浸润至血栓内的速度具有一定相似性｡在临床实践中,约20%的ACTO患者在发病后24h内发生自发再灌注,而高达80%的患者在发病后7d内发生自发再灌注｡本研究中,术后4周才观察到血栓溶解现象,兔ACTO模型未发生自发再灌注;此外,小鼠ACTO模型中血栓形成4周后也未出现自发再灌注现象｡Zrzavy等对16例缺血性脑梗死患者尸检脑组织进行研究,巨噬细胞最晚能在发病12周内死亡患者脑组织中检测到｡这与本研究观察到术后1周内的现象一致,提示兔ACTO模型能部分模拟人类ACTO病变的病理过程｡我们进一步观察到术后1周内血栓逐渐增大的同时,血栓内巨噬细胞数量也随之增加,表明巨噬细胞可能通过调控炎症反应来促进血栓形成｡而Wu等的研究结果显示,炎性小体能诱导巨噬细胞发生焦亡､释放富含组织因子的微囊泡来启动凝血级联反应,凝血级联反应的激活最终导致凝血酶介导的纤维蛋白生成和阻塞性血栓的形成｡由此可知,炎症反应不仅会引发血栓形成,血栓形成后也会加重炎症反应｡一项研究提出,血栓内M1及M2型巨噬细胞数量可能会影响血栓溶解速度,本研究通过观察术后4周血栓溶解时M0和M2型巨噬细胞浸润行为发现,血栓溶解处(即血栓核心)聚集有许多巨噬细胞,表明巨噬细胞可能通过迁移进入血栓内来发挥血栓溶解作用｡此外,Haider等研究表明,巨噬细胞可作用于中性粒细胞胞外陷阱的降解,进而导致血栓溶解｡多项研究表明,血栓中巨噬细胞受炎症因子诱导而分泌一些生长因子,促进血栓内新生血管生成,有助于卒中患者自发再灌注､减轻缺血后脑组织损伤｡本研究观察术后8周时血栓内巨噬细胞浸润行为,结果表明,巨噬细胞中的M2型巨噬细胞主要聚集于血栓核心的新生血管处,提示M2型巨噬细胞在闭塞血管自发再通中发挥重要作用｡综上,本研究认为血栓内巨噬细胞浸润行为在血栓形态和血栓组成的演变中发挥重要作用｡

本研究成功构建了ACTO动物模型,并对其闭塞段血管的血栓组织进行了组织病理学分析,首次展示了血栓形成后12周内巨噬细胞的动态演变规律｡巨噬细胞在血栓形成和血栓纤维化过程中发挥着重要作用,并可能促进了血栓溶解和血栓内新生血管形成,进而促进闭塞血管自发再灌注的发生｡本研究仍存在一定的局限性｡巨噬细胞在ACTO演变中的作用是一个极其复杂的过程,我们的数据仅揭示了不同时间段巨噬细胞的浸润行为与血栓演变之间的关系,但并未对与巨噬细胞调控的炎症反应相关的细胞和细胞因子进行检测｡后续研究有必要借助临床样本进行进一步验证｡