一名7岁罕见病患者，症状为进行性肌无力，肌酸激酶增高，既往各种遗传检测均显示阴性结果。通过全基因组测序（WGS）和转录组测序（RNA-seq）分析，在该患者肌病相关基因和常染色体隐性遗传基因中发现了127个非编码区变异，其中86个变异可以进行剪接识别。此外，在患者的LMNA基因内含子区域发现一个新发26bp深度缺失，导致6号内含子滞留。LMNA基因与多种肌病相关，这些疾病与该患者的表型一致^[1]。

这只是测序技术帮助罕见病患者实现精准诊疗的众多案例中的一个。

罕见病由于发病率极低，且临床表现复杂多样，通常诊断困难。传统的临床诊断方法不仅耗时费力，且准确性较低。测序技术作为精准医学的核心支柱，为罕见病的精准诊疗带来了革命性改变，使人们对罕见病分子机制的认知达到了前所未有的深度。基于WGS、RNA-seq等测序技术，研究人员不仅可以提高罕见病的诊断效率和准确性，还能鉴别疾病亚型，指导个性化治疗和预后评估，并推动药物研发进展。

罕见病诊断中的测序策略

上述案例中使用了WGS和RNA-seq，是罕见病诊疗中常用的测序策略，此外还包括全外显子测序（WES）、靶向测序、单细胞测序等。不同测序策略的靶标区域、类型和适用场景各不相同，本文将着重探讨WGS和RNA-seq在罕见病诊疗中的应用。

01 WES：有效诊断罕见病，但仍存在局限性

WES是对编码序列的外显子区域进行测序，是临床中应用较多的罕见病诊断手段，在已知致病基因变异和新致病基因挖掘方面均发挥着重要作用。目前WES的平均罕见病诊断率约在25%-50%^[2]。但WES很难检测结构变异（SV）、重复扩增和深度内含子区变异等，导致很多通过其他方法诊断（肌肉活检、代谢检测等）的案例无法得到明确分子诊断。

02 WGS：提高罕见病诊断率，做为一线检测具成本效益

理论上，WGS能够检测基因组的所有潜在变异，包括单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失（Indel）和SV。基于目前的回顾性研究分析，WGS的诊断率在19.1%-68.3%之间^[3]。一项荟萃分析显示，在罕见病患者的基因检测中，WGS诊断率比WES高1.2倍，WGS发现了更多的新基因，且临床效用高于WES^[4]。

2021年10月，BMJ期刊报道了第一次在国民医疗服务体系（NHS）中验证WGS的罕见病诊断有效性的结果^[5]。通过对疑似线粒体疾病患者的外周血DNA进行WGS分析（Illumina TruSeq、HiSeq 2500和HiSeq X），31%获得了明确或可能的基因诊断，证实WGS在疑似线粒体病患者中是一种有用的诊断方法。

图：NHS研究分析概述和诊断信息。来源：BMJ

英国国家医疗系统13,037名参与者（9802人患有罕见病）的WGS分析（Illumina TruSeq，HiSeq2500）结果显示^[6]，WGS为1138名广泛表型参与者提供了遗传诊断，并发现了4种新的非编码变异，证实在常规医疗保健中，使用WGS可以简化诊断并发现基因组编码区和非编码区未知的致病变异。

图：英国国家医疗系统研究概述。来源：Nature

在临床中，除了诊断率外，成本效益也是需要考虑的重要因素。WGS、WES与常规标准检测在疑似罕见遗传病儿童中的成本效益评估结果显示，与WES和标准检测相比，将WGS作为一线诊断检测更具成本效益^[7]。

03 RNA-seq：WES/WGS的有效补充手段

对于部分无法确诊的患者，RNA-seq可以作为WES/WGS的有效补充手段，快速准确地进行基因表达量的测定，识别未知转录本、SV、可变剪接、基因融合等，从而得到全面的遗传信息，可提高罕见病诊断率和发现新候选基因。RNA-seq在许多肌病及线粒体疾病中已有许多成功应用案例。

例如，在一项将RNA-seq用于罕见病诊断的研究中，利用RNA-seq从遗传学角度诊断罕见肌肉疾病，检测骨骼肌样本RNA，表明RNA-seq能有效鉴别位于外显子区或深内含子区的有害剪接位点变异，总体诊断率可达35%^[3]。Yépez, V.A.等利用皮肤成纤维细胞RNA-seq，帮助205例WES未诊断的病例中16%（32例）的患者获得了诊断^[2]。

图：RNA-seq在孟德尔遗传病诊断中的临床应用。来源：Genome Med

在临床环境下，部分患者的疾病相关组织（如肌肉活检）和成纤维细胞都较难获得，这限制了组织特异性RNA-seq的应用范围。因此，基于外周血的RNA-seq在样本获取受限的未诊断罕见病患者的遗传诊断中得以广泛探索。

Frésard等评估了血液RNA-seq作为罕见疾病诊断手段的效用^[8]。血液RNA-seq在6例未诊断患者（7.5%）中识别并验证了致病基因，提高了16.7%患者候选基因的诊断效力。值得注意的是，对于神经系统相关疾病，虽然血液并不是代表性的组织样本，但RNA-seq仍在5例神经系统异常患者发现了候选基因。此外，基于血液的bulk-RNA-seq能够评估71%的意义不明变异（VUS），对于DNA测序中没有候选VUS的患者或候选VUS不影响剪接的患者，SpliceAI（Illumina）联合RNA-seq还可检测到新的发育障碍相关候选基因^[9]。

图：利用血液RNA-seq分析罕见病基因。来源：Natrue Medicine

04 WGS+RNA-seq：助力罕见病诊断更上一层楼

在实际临床应用中，需要综合考虑患者的临床表现、家族遗传史、检测成本、时间等因素来选择合适的测序策略。对于疑难复杂的罕见病，可能需要多种测序策略的联合应用。近年来，许多团队在尝试WGS与RNA-seq联合应用，以获得不同程度的分子诊断率提高。

Genetics in Medcine报道了WGS联合RNA-seq的测序策略在罕见孟德尔遗传病诊断中的临床应用^[1]。研究显示，WGS联合RNA-seq可以将阳性诊断率从31%提高到38%，同时RNA-seq帮助18%的病例提高了致病性证据等级。

图：WGS联合RNA-seq检测到SEPSECS外显子跳跃。来源：Genetics in Medcine

罕见病治疗及药物开发中的测序应用

2019年，顶级医学期刊NEJM发文报道了罕见病患者Mila Makovec经WGS和RNA-seq成功找到致病基因突变^[10]。研究团队基于该突变快速研发靶向药物，使Mila得到了有效治疗。

Mila患有致命性的极罕见Batten病。美国波士顿儿童医院团队利用trio WGS，发现在CLN7基因内，Mila及其母亲同时携带一个特殊的插入序列SVA（SINE - VNTR - Alu）结构，并通过RNA-seq证实SVA结构会干扰正常的基因剪接功能。基于此，研究团队研发了一款针对Mila特定突变的新药“milasen”，并经过了临床试验和FDA的批准。经过一年的milasen治疗，Mila的症状得到明显改善，且没有不良反应发生。

图：Mila的基因诊断，来源：NEJM

在Mila的诊疗案例中，药物研发在WGS和RNA-seq的帮助下加速进行。传统的药物研发过程需要进行大量的试验和筛选，耗时费力，而且成功率较低。测序技术的进步打破了传统药物研发过程中的技术瓶颈，不仅可以快速找到药物靶点，还能筛选适合某种药物治疗的患者亚群，监测药物不良反应，降低成本，提高研发成功率。

总体而言，测序技术主要从以下几个方面促进罕见病药物研发：

01 药物靶点发现与筛选应用：

测序技术可以对罕见病相关基因进行全面分析，帮助研究人员发现新的药物靶点并进行筛选，以及探索药物与基因之间的作用关系，进而开发出更加精准、高效的药物治疗方案。PCSK9抑制剂是展示基因测序促进药物研发的经典案例。2003年，研究人员利用基因测序在家族性高胆固醇血症患者的PCSK9基因中发现了功能获得性突变^[11]。12年后，美国FDA年批准了第一个PCSK9抑制剂Evolocumab，用于家族性高胆固醇血症的治疗。

02 临床前研究应用：

传统的罕见病药物临床前评估所需时间和成本过高，测序技术可帮助快速识别生物标记物、阐明药物的作用机制或耐药性，加速体外细胞实验和动物模型实验，验证药物的有效性和安全性。例如利用罕见病患者来源的类器官模型评估个性化反义寡核苷酸（ASO）疗法。在针对两位DMD患者的个性化ASO设计和类器官检测分析中，RNA-seq确认了剪接恢复正常^[12]。

03 临床试验应用：

测序技术还可用于优化临床试验设计，提高罕见病药物研发效率和成功率。在测序技术的帮助下，研发人员可以筛选出适合某种治疗方案的患者亚群，并预测可能出现的副作用。此外，测序技术还可以帮助识别患者分层的生物标记物、监测药物反应和疾病进展。在抗体偶联寡核苷酸疗法DYNE-101治疗1型肌强直性营养不良（DM1）的临床试验中，利用RNA-seq发现接受DYNE-101治疗患者的DMPK基因RNA水平显著下降^[13]。

 展 望 

目前，罕见病诊疗仍面临着诸多挑战。随着测序技术的不断发展，相信罕见病的精准诊断能力将进一步提升，相关药物研究也将取得突飞猛进的发展。据不完全统计，仅2024年，全球批准了近200个罕见病药或新适应症^[14]，中国全年批准罕见病药39个，覆盖34种罕见病^[15]。

除本文探讨的WGS和RNA-seq外，其它测序及分析技术对促进罕见病诊疗和药物研发也有巨大的潜力。长读长测序技术可以克服短读长测序在检测复杂SV方面的局限性；多组学分析可将基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等结合，获得更全面的疾病信息。人工智能技术可以帮助提高测序数据的挖掘分析和解读效率，减少漏诊和假阳性。此外，研究机构与企业、医疗机构之间的合作，可通过共享数据和专业知识，使整个研究过程更加协同高效。期望未来能有更多罕见病患者获得有效治疗，改善预后。

参考资料

[1] Hane Lee, PhD, Alden Y. Huang, PhD, Lee-kai Wang, et al. Diagnostic utility of transcriptome sequencing for rare Mendelian diseases. Genetics in Medcine, Volume 22, Issue 3, March 2020, Pages 490-499. https://doi.org/10.1038/s41436-019-0672-1

[2] Yépez, V.A., Gusic, M., Kopajtich, R. et al. Clinical implementation of RNA sequencing for Mendelian disease diagnostics. Genome Med 14, 38 (2022). https://doi.org/10.1186/s13073-022-01019-9

[3] Jaramillo Oquendo, C., Wai, H.A., Rich, W.I. et al. Identification of diagnostic candidates in Mendelian disorders using an RNA sequencing-centric approach. Genome Med, 2024 Sep 9; 16;  https://doi.org/10.1186/s13073-024-01381-w

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[5] Katherine R Schon, Wei Wei, Arianna Tucci, et al. Use of whole genome sequencing to determine genetic basis of suspected mitochondrial disorders: cohort study. BMJ 2021; 375 doi: https://doi.org/10.1136/bmj-2021-066288

[6]Turro, E., Astle, W.J., Megy, K. et al. Whole-genome sequencing of patients with rare diseases in a national health system. Nature 583, 96–102 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2434-2

[7] Mario Cesare Nurchis, Francesca Clementina Radio, Luca Salmasi, et al. Cost-Effectiveness of Whole-Genome vs Whole-Exome Sequencing Among Children With Suspected Genetic Disorders. JAMA Netw Open. 2024;7(1):e2353514. doi:10.1001/jamanetworkopen.2023.53514

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[9] Jaramillo Oquendo, C., Wai, H.A., Rich, W.I. et al. Identification of diagnostic candidates in Mendelian disorders using an RNA sequencing-centric approach. Genome Med, 2024 Sep 9; 16;  https://doi.org/10.1186/s13073-024-01381-w

[10] Kim J, Hu C, Moufawad El Achkar C, et al. Patient-Customized Oligonucleotide Therapy for a Rare Genetic Disease. N Engl J Med. 2019; 381(17): 1644-1652. doi:10.1056/NEJMoa1813279 https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1813279

[11] Abifadel M, Varret M, Rabes JP, et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nat Genet, 2003, 34(2): 154-156.

[12] Means, J.C., Martinez-Bengochea, A.L., Louiselle, D.A. et al. Rapid and scalable personalized ASO screening in patient-derived organoids. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08462-1

[13] https://mp.weixin.qq.com/s/7qLN49y-rOlbADypHKYoPA

[14] https://mp.weixin.qq.com/s/qkNzZYLAWPOIBq_N0d-VqA

[15] https://mp.weixin.qq.com/s/vhnsiVRswEudAJzhKe4ozw