糖尿病是一种常见疾病，氧化应激、炎症或糖脂毒性导致的胰腺β细胞功能障碍在糖尿病中发挥关键作用。糖尿病患者的伤口愈合通常极其缓慢，有些伤口甚至不能完全愈合，感染使治疗更加复杂。然而，目前尚无有效的治疗方法。已有报道称治疗糖尿病患者的伤口的新方法，如一氧化碳和光疗，但这些方法没有得到广泛应用，治疗也不够彻底。目前通过对糖尿病创面缺氧的研究，我们发现缺氧诱导因子-1α在促进难治性创面愈合方面可能是有效的。缺氧诱导因子-1α在缺氧环境中迅速降解，并在缺氧条件下迅速介导细胞对缺氧的适应。缺氧诱导因子-1α是细胞代谢、炎症、纤维化、血管重塑和血管生成的重要因子。

目的：抑制细胞对缺氧的适应可引起持续性炎症，从而增加糖尿病患者的组织损伤并使伤口愈合复杂化。调节细胞对缺氧环境的适应有助于有效的创面修复。缺氧诱导因子(hypoxia -inducible factor, HIF)-1α是细胞缺氧的关键调节因子。细胞外泡(EVs)调节创面修复。本研究探讨了脂肪源性干细胞细胞外囊泡(ADSCs-hEVs)中HIF-1α过表达在糖尿病创面修复中的作用机制。

材料与方法：研究HIF-1α在糖尿病患者和健康参与者中的表达情况。我们进行了人类脂肪干细胞(HADSCs)的原代培养，最后在37°C的5%CO2湿度环境中进行了培养。类似地，我们进行了人成纤维细胞(HF)的原代培养。将糖尿病患者和正常人的皮肤组织立即−80°C保存，进行定量逆转录聚合酶链式反应(QRTPCR)检测。高通量测序、GO和KEGG分析显示，ADSCs细胞外小泡缺氧环境可能通过影响细胞代谢、分化和TGF-β分泌，或通过改变PI3K/AKT通路增加HIF-1α的表达。采用Western blotting、EdU实验、transwell实验和迁移实验研究ADSCs-hEVs加入对细胞增殖和迁移的影响。在体内，分别在7、14和21天后，采用免疫组织化学、qRT-PCR、Masson染色和H&E染色评价糖尿病创面愈合的重要因素。

结果：糖尿病患者皮肤HIF-1α表达降低，白细胞介素(IL)-6表达增加，生长因子相关指标降低。与ADSCs - EV相比，ADSCs-hEVs显著增加生长因子的表达和分泌。在体内，与ADSCs - EV相比，ADSC-hEV治疗糖尿病创面的愈合速度加快，愈合质量提高。

图1 HADSC的标识。(A)流式细胞仪检测hADSCs的免疫表型特征。(2)茜素红染色(100×)可见钙结节。(C)油红O染色检测脂簇。(D)免疫印迹法检测各组hADSCs中缺氧诱导因子-1α的蛋白表达水平。Bars，25μm。

图2 ADSCs-EVS的特性。(A)透射电子显微镜下观察的形态。巴，200μm。(B)颗粒大小分布。(C)Western blot检测EVS表面标志物。(D)PKH26标记的ADSCs-EVS内化的荧光显微镜分析。Bars，100μm。

图3 正常人皮肤样本和糖尿病皮肤样本之间mRNA水平的差异。(A)定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)分析缺氧诱导因子-1(α)、碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)、白细胞介素-6(IL-6)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(。(B)GO和KEGG富集差异表达的miRNAs。KEGG通路中的重要术语。N=5。数据以平均值±SD表示。

图4 ADSCs-HEV可显著促进HF的增殖和迁移。(A)ADSCs-HEV处理的HF的迁移能力，通过划痕和T-R试验测定。(B)分析经治疗的心衰患者的蛋白质表达水平。数据以平均值±SD表示。*，vs ADSCs-EVS；#，vs ctrl；n=3。**P<0.001，##P<0.001，*P<0.0001，#P<0.0001。Bars，100μm。

图5 ADSCs-HEV可促进HF细胞外基质和生长因子的表达和分泌。(A)定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)分析bFGF、MMP1、VEGF、TGF-β基因表达水平。(B)EDU法检测细胞增殖。*，vs ADSCs-EVs；#，vs Ctrl；(C)Western-blot分析不同浓度的对照组、ADSCs-EVs、ADSCs-HEV和ADSCs-cEVs诱导的p-AKT蛋白水平。L Y294002抑制对照组、ADSCs-EVs、ADSCs-HEV和ADSCs-cEVs诱导的PI3K/AKT激活。数据以平均值±SD表示。*VS ADSCs-HEVS+Ly；#，VS ADSCs-EVS+Ly；+，VS ADSCs-CEVS+Ly；n=3。*P<0.0001，**P<0.01，*P<0.0001，#P<0.001，#P<0.0001，+P<0.0001。

图6 ADSCs-HEV通过PI3K/AKT促进细胞增殖和迁移。(A)EDU实验显示，与ADSCs-EVS相比，抑制剂L Y294002可抑制ADSCs-HEVS处理的HF增殖。(2)定量RT-PCR检测术后14天创面组织中碱性成纤维细胞生长因子、大肠杆菌、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子-β的表达水平。(C)ADSCs-HEV处理后0、3、7、14d。数据以平均值±SD表示。*VS DW+EVS；#，VS DW+PBS；ns，VS DW+PBS；n=3。*P<0.0 5，**P<0.0 1，*P<0.0001，#P<0.0 5，##P<0.0 1，#P<0.00001，+P<0.0001。Bars，100μm。

图7 术后观察创面愈合质量和愈合速度。(A)术后14d取创面进行HE和Masson染色，术后7d观察创面组织中IL-6和IL-10的表达。术后21d观察创面组织中α-SMA、β、Coli、CollⅢ的表达。N=3。(B和C)Masson、免疫荧光和免疫组织化学统计分析。数据以平均值±SD表示。*，VS DW+EVS；#，VS DW+PBS；n=6。**P<0.001，*P<0.0001，#P<0.001，#P<0.0001。Bars，100μm。

结论：ADSCs- hEVs组创面愈合速度和愈合质量明显提高，可抑制早期炎症反应，促进生长因子和细胞外基质相关指标的分泌和表达。

原文出处：

Wang J,  Wu H,  Zhao Y,et al.Extracellular Vesicles from HIF-1α-Overexpressing Adipose-Derived Stem Cells Restore Diabetic Wounds Through Accelerated Fibroblast Proliferation and Migration.Int J Nanomedicine 2021;16