儿童急性髓系白血病(Pediatric acute myeloid leukemia，pAML)是一种异质性恶性血液疾病，常由基因重排驱动。尽管在患者危险度分层和针对性治疗上有所进步，但患儿的5年生存率仍在75%左右，特别是复发患者的预后不佳。与成年人的AML相比，儿童AML缺乏有效的靶向药，更需要针对细胞异质性的研究来探索复发的细胞机制和寻找靶向药物。

近期，加拿大 Marco Marra 研究组在 Cancer Cell 上发表题为 A longitudinal single-cell atlas of treatment response in pediatric AML 的文章，采用单细胞测序技术,纵向分析了28名pAML患者在不同治疗阶段(初诊、缓解和复发)的样本，特别是其细胞组成和转录调控状态。他们发现：1) 不管原发肿瘤的驱动突变和细胞组成如何,复发样本中处于始祖细胞状态的细胞数量较丰富。2) 与初诊时相比,复发样本中的肿瘤细胞分化状态从髓系向淋巴系和红细胞系转化。

研究组共选取了参与AAML1031临床试验的28名的pAML患儿，其中24名患儿发生了复发，涵盖了多种已知的基因变异，包括MLL重排、RUNX重排、CBFB重排和FLT3-ITD。在单个患者的纵向分析中，可看出初诊、缓解和复发的样本中的细胞在基因表达层面（单细胞RNA测序结果）和基因调控层面（单细胞ATAC测序结果）都明显分离，代表细胞在细胞类型和分子层面性状有所不同。

（上）同一个病人的三次活检样本，每一个点代表一个细胞。红色：细胞来自初诊样本；绿色：缓解；蓝色：复发。左：基因表达层面；右：基因调控层面。（下）在初诊和复发样本中发现大量含有变异基因的细胞，而在缓解样本中几乎没有。

以正常的骨髓细胞类型做为参考，研究组进一步分析pAML初诊时的细胞类型和组成，发现不同基因突变重组驱动的pAML在细胞类型上也有所不同，例如MLL重排的pAML细胞类似髓系成熟细胞，RUNX重排的pAML细胞类似造血干细胞和祖细胞，CBFB重排的pAML细胞不仅有大量类似造血干细胞，同时也含有不少单核细胞，而FLT突变的pAML细胞则类似造血干细胞和祖细胞。

左：Reference：正常骨髓的细胞类型组成；右侧四图：不同基因突变重排驱动的pAML的在初诊时的样本，细胞投影到正常骨髓的细胞类型进行分类；HSC：造血干细胞；Progenitor：祖细胞；GMP：粒细胞-单核细胞前体；Monocytes：单核细胞。

研究组进一步分析了各型pAML在复发时的细胞类型组成。相比于初诊，复发时大部分类型的pAML都有更大量的造血干细胞和祖细胞。

左：Reference：正常骨髓的细胞类型组成；右侧四图：不同基因突变重排驱动的pAML的在复发时的样本，细胞投影到正常骨髓的细胞类型进行分类。

为了理解pAML复发中细胞类型变化的分子机制，研究组运用单细胞ATAC测序来探索转录因子活性以及细胞调控的特性。他们发现，比较pAML初诊和复发的样本，部分转录因子的活性在复发过程中发生了明显变化。例如在MLL重排的pAML复发时，和髓系细胞分化相关的转录因子（如CEBP，APF/CREB，AP-1等）减少，而其他转录因子增加，包括与始祖状态更相关的RNAX，CBFB，HOX，与淋巴细胞相关的ENBF1等。这个结果在基因转录的调控层面，解释了造血干细胞、祖细胞以及其他系细胞（淋巴系，红细胞）在复发时增加的现象。

红色：在MLL重排型pAML初诊时更富集的转录因子；蓝色：在MLL重排型pAML复发时更富集的转录因子。

随后，研究组分析了这些变化是否能解释硼替佐米对部分pAML患儿效果不佳。硼替佐米是一种泛素蛋白酶抑制剂，效用是抑制NF-kB通路活性。从本研究中可以看到，在初诊时，NF-kB活性较高，而在复发时，NF-kB活性几乎没有了。NF-kB在部分髓系细胞中表达高，而在干细胞和其他细胞中表达不高。综上，针对NF-kB的硼替佐米也许并不适合pAML。

最后，研究组运用这些数据，探索是否有更佳的治疗靶点。在pAML复发样本中，造血干细胞和祖细胞有多系分化的潜力，相比较初诊时偏向髓系的分化方向更为多样。这种多样化可能造成了肿瘤细胞有更强的抗药性。在多个pAML的复发样本中，研究人员观察到MEF2C的活性增加，且其增加和CEBP和AP-1有逆相关性，猜测MEF2C引导的淋巴系细胞分化可能是导致复发的一个因素。而B淋巴细胞相关的基因可能成为治疗pAML的新靶点。

总之，本研究从细胞层面增加了人们对pAML复发的机制的理解，但受限于样本量较小，以及活检部位不同等混杂因素。后续研究如能扩大样本量，增加样本一致性，并增加功能验证实验，将为开发新的靶向疗法，提高患儿生存率提供重要方向。