自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK细胞 )，是肿瘤和病毒感染免疫中的“第一反应者”，可自发识别体内异常细胞，并通过细胞毒性作用将其迅速清除，同时产生各类促炎细胞因子和趋化因子，招募和激活其他免疫细胞以启动适应性免疫反应。

NK细胞已经成为抗肿瘤免疫治疗的重要靶点。今天，我们来了解一下如何激活人体免疫“第一反应者”——NK细胞。

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NK细胞激活机制

NK细胞是由一系列激活和抑制受体转导的信号之间的动态平衡调节的。正常细胞表面通过表达MHC-I分子，引发NK细胞的抑制性信号传导，避免NK细胞的攻击。

然而，病毒感染的细胞或肿瘤细胞通常下调MHC-I的表达，逃避依赖于检测MHC-I呈递的抗原肽的CD8+T细胞的识别。相反，这种MHC-I抑制性受体配体的缺失和/或活化受体配体的上调，可使NK细胞激活，从而引发NK细胞的自发攻击。NK细胞激活后，通过释放大量的穿孔素和颗粒酶来诱导靶细胞凋亡。

NK细胞杀伤肿瘤细胞主要通过以下四种方式完成，分别是：

直接杀伤

NK细胞直接通过胞吐作用，释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性颗粒，穿孔素在靶细胞表面穿孔，使颗粒酶进入靶细胞诱导靶细胞凋亡。

诱导细胞凋亡

活化NK细胞表达Fas（CD95）配体和TRAIL（肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体）分子，诱导CD95+靶细胞和TRAIL受体阳性的靶细胞通过内源酶的级联反应发生凋亡，使靶细胞进入程序性凋亡状态。

细胞因子介导杀伤

NK细胞能合成和分泌多种细胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL1、IL5、IL8、IL10和G-CSF等），直接作用于靶细胞，或通过进一步激活其他种类免疫细胞攻击靶细胞。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）

NK细胞低亲和力的CD16分子与靶细胞IgG抗体复合物结合后，活化蛋白酪氨酸激酶（PTK），使PLC γ的酪氨酸磷酸化，裂解膜磷酯酰肌醇为三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油，IP3增加细胞内游离钙浓度，进而释放细胞毒性物质（如穿孔素和颗粒酶）。

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细胞因子激活NK细胞

细胞因子是维持多种免疫细胞激活和功能性的关键成分，通过多种激活性细胞因子或抑制性细胞因子的拮抗剂，能够刺激并增强患者NK细胞的抗肿瘤作用。

IL-2

IL-2可直接刺激T细胞和NK细胞的增殖和活化。最初发现用IL-2刺激人外周血单核细胞会扩增细胞毒性细胞，命名为淋巴细胞活化杀伤细胞（LAK）。随后的研究发现，LAK细胞对肿瘤的破坏主要由NK细胞介导。后续研究发现，IL-2可诱导抑制性调节性T细胞（Treg）的产生，其限制了IL-2激活NK细胞的应用。

IL-15

IL-15是IL-2最有前途的替代品。重要的是，IL-15刺激NK和CD8+T细胞，但不刺激Treg细胞。体外研究表明，IL-15可以增强被TME（肿瘤微环境）耗尽的NK细胞的功能。在缺氧条件下，用IL-15治疗功能失调的肿瘤来源的NK细胞，可以恢复线粒体的完整性，增加颗粒酶B的表达，减少细胞凋亡，增强NK细胞毒性和IFNγ的产生[1]。

IL-12

IL-12主要由抗原呈递细胞，特别是DC和巨噬细胞产生，刺激CD8+T细胞和NK细胞的募集、效应功能和IFNγ的产生。除了直接激活NK细胞外，IL-12还刺激Th1产生IFNγ和IL-2，从而刺激NK细胞产生更多的IFNγ、穿孔素和颗粒酶B[3]。

IL-12全身给药会引起多种不良副作用，在最大耐受剂量下也只能发挥有限的抗癌功效，目前正在开发替代的IL-12递送方法（如抗体融合的IL-12、IL-12的DNA/RNA的直接递送、瘤内注射外泌体表达的的IL-12）以期改善IL-12疗效。

IL-18

IL-18是一种促炎细胞因子，由多种细胞产生，包括髓细胞、肠上皮细胞、角质形成细胞和内皮细胞。IL-18（与IL-12联合）能够诱导NK细胞表达FASL、增强NK细胞产生IFNγ和TNF的能力、促进NK细胞增殖，并通过诱导CCL21、CCR7的表达促进NK向次级淋巴器官迁移。

IL-21

IL-21由Th17细胞和DC细胞产生。IL-21通过刺激NK细胞增加穿孔素和颗粒酶B的表达，并上调NKp30和NK细胞受体2B4来增强NK细胞的成熟和增殖，并增强其细胞毒性活性[5]。常IL-2、IL-15、IL-18等细胞因子联合使用。

TGF-β抑制剂

TGFβ能够抑制NK细胞功能，并促进其分化为ILC1，成为毒性大大降低的组织驻型细胞，对肿瘤的杀伤作用大幅度减弱，抑制肿瘤微环境中的TGFβ是恢复NK细胞功能的重要策略。针对TGFβ的药物大致有三类：中和抗体、配体陷阱、受体激酶抑制剂。

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免疫检查点抑制激活NK细胞活性

多少肿瘤的发展与NK细胞功能异常有关。因此，NK细胞功能的恢复可能是抗肿瘤免疫治疗的潜在选择。在T细胞参与的抗肿瘤过程中，免疫检查点抑制已研究成功。NK细胞同样也有相同的抗肿瘤机制。

在NK细胞背景下，尝试基于T细胞的免疫检查点抑制剂（例如CTLA-4和PD-1抑制剂）的组合，如抗PD-1和抗PD-L1抑制剂也已显示增强NK细胞介导的细胞毒性。通过研发更新的免疫检查点（例如B7-H3，CD200R，CD47和Siglecs7/9），将这些检查点组合以产生协同的抗肿瘤反应似乎更加合乎逻辑。

除此之外，还有一些NK特有免疫检查点：

NKp44

NKp44，其胞质结构域包含一个免疫受体酪氨酸抑制（ITIM）基序，表达PCNA的肿瘤细胞与NK细胞接触结合时，通过NKp44-PCNA轴传导抑制信号。

KIR3DL3

KIR3DL3，可能受免疫抑制性TME诱导而表达上调，通过与配体HHLA2结合传导抑制信号。KIR，第一个开发用于刺激NK细胞反应的ICI抗体。

NKG2A

NKG2A，主要存在于实体瘤浸润性NK细胞中，其配体HLA-E在多种肿瘤中表达被上调。

Front Immunol. 2020 Feb 13;11:167.

如图，NK细胞中的免疫检查点抑制作用：

（A）NK细胞表面表达的抑制性受体以蓝色棒表示，肿瘤细胞表达受体的配体以橙色棒表示。

（B）矩形框代表通过其进行抑制的受体的细胞内结构域。这些受体中（KIR，ILT2，NKG2A和CD94，TIGIT和CD96，Siglec-7/9，PD-1和SIRPα）在其细胞质尾巴中带有1-3个ITIM，并观察到基于ITIM的抑制作用，受体的抗体显示在红色方框内。

（C）其他几种免疫细胞（包括T细胞，B细胞和髓样细胞）在其表面也表达这些受体，如图最左侧所示，对应每个免疫检查点受体的表达细胞。

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增强ADCC作用的策略

NK细胞可通过CD16受体介导的ADCC，杀死IgG1或IgG3抗体靶向的细胞。NK细胞表面CD16的不同形态，会影响CD16与抗体Fc端的亲和力。

具体来说，CD16蛋白第158位的氨基酸为苯丙氨酸（158F）时，与Fc的亲和力低，而这一位置上的氨基酸为缬氨酸（158V）时，与Fc的亲和力高。新一代单克隆抗体疗法很多对Fc端进行了修饰，改善了它们与CD16的结合，促进了ADCC的产生。同时，很多抗体在合成时使用了预防抗体Fc端岩藻糖基化的哺乳动物培养系统，增强了它们与CD16的结合。

双特异性抗体

双特异性抗体，可同时与激活NK细胞的受体和肿瘤抗原相结合，促进更有效和持久的NK介导细胞毒性。与单抗不同，这些融合蛋白可以被设计成与多种不同的肿瘤抗原和NK受体相结合，并且可以利用抗体可变区片段（Fv）与CD16结合，保证它们可以与158V C16和158F C16有效结合。类似的蛋白设计已经在双特异性T细胞衔接器（BiTE）中得到应用。

目前，Affimed公司开发的AFM13是临床进展最快的CD16双特异性抗体之一。这是一款靶向CD30的双特异性抗体。在治疗霍奇金和非霍奇金淋巴瘤患者的1期临床试验中，它与脐带血来源的NK细胞联用，在治疗的12名患者中，达到100%的客观缓解率。

三特异性抗体

三特异性NK细胞衔接器不但可与肿瘤抗原和CD16受体结合，还可包含IL-15，从而与IL-15受体（位于NK细胞表面）相结合，增强NK细胞的活性。三特异性抗体，由于具有同时与不同NK细胞受体结合的潜力，因此正在成为NK细胞免疫疗法的一个令人兴奋的前沿。不过，哪些激活性受体组合能够最大程度增强NK细胞的抗癌活性仍然需要更多研究。

Nat Rev Drug Discov. 2022 Aug;21(8):559-577. 

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过继性NK细胞疗法

NK细胞是研究人员开发新型免疫疗法的理想选择之一。目前，正在开发的NK细胞治疗产品主要有两类：一类是自体或是异体NK细胞治疗产品，另一类是CAR-NK产品。

在增强NK细胞功能方面，在体外培养过程中使用细胞因子进行刺激，常用的细胞因子是IL-2。近年来，IL-12，IL-15， IL-18，IL-21等刺激因子也被用于体外刺激NK细胞，并且能够诱导成长期生存，具有记忆能力的NK细胞。

CAR-NK可赋予NK细胞靶向特定肿瘤的能力。CAR-NK细胞的优势是细胞因子释放综合征风险（CRS）更小，神经毒性更小。即使CAR-NK细胞失去了CAR，仍然可通过内在表达的激活性受体识别和杀伤肿瘤细胞。

除了CAR-NK，研发人员正在探索增强NK细胞功能的其他基因工程策略，包括通过表达趋化因子受体，促进肿瘤浸润。基于ADCC的疗法可以在NK细胞上表达高亲和力的138V CD16受体，与激发ADCC的抗体联用构成组合疗法。

最后，使用CRISPR-Cas9基因编辑系统可以从NK细胞中敲除副调控因子。这些手段为构建更好的NK细胞疗法提供了多种可能性。

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文末小结

自然杀伤细胞（NK细胞）具有独特的抗肿瘤效应，不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。早期临床数据表明：NK细胞非常适合用于异体治疗环境。

临床研究表明，NK细胞在治疗血液系统恶性肿瘤方面具有安全性和有效性。重要的是，无论采用哪种方法，NK细胞疗法都一直显示出良好的安全性。迄今为止，没有观察到CRS或GVHD。然而，大多数报道的成功仅限于血液系统恶性肿瘤，并非所有患者都对NK细胞治疗有反应，有些患者最终会复发。

CAR-NK细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效。相信，基于NK细胞的新型细胞疗法可能会引发肿瘤免疫治疗的革命性进展。

参考资料：

[1] Laskowski, T.J., Biederstädt, A. & Rezvani, K. Natural killer cells in antitumour adoptive cell immunotherapy.Nat Rev Cancer (2022). 

[2] Maskalenko et al., Harnessing natural killer cells for cancer immunotherapy: dispatching the first responders. Nature Reviews Drug Discovery,  (2022).

[3] Le Saux and Schvartzman Advanced Materials and Devices for the Regulation and Study of NK Cells. Int. J. Mol. Sci.,  (2019).

[4] Zhang et al.,. CAR-NK cells for cancer immunotherapy: from bench to bedside. Biomarker Research,(2022)

[5]Bald T et al. The NK cell-cancer cycle: advances and new challenges in NK cell-based immunotherapies. Nat Immunol. 2020 Aug;21(8):835-847.

[6]Maskalenko NA et al. Harnessing natural killer cells for cancer immunotherapy: dispatching the first responders. Nat Rev Drug Discov. 2022 Aug;21(8):559-577.

Zhou T et al. IL-18BP is a secreted immune checkpoint and barrier to IL-18 immunotherapy. Nature. 2020 Jul;583(7817):609-614.

[7]Liu S et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. J Hematol Oncol. 2021 Jan 6;14(1):7.

[8]Khan M et al. NK Cell-Based Immune Checkpoint Inhibition. Front Immunol. 2020 Feb 13;11:167.