肿瘤细胞与正常细胞最根本的区别，在于它的原癌基因或抑癌基因发生了突变，这些突变有可能导致其产生肿瘤特异性抗原（tumor-specific antigens, TSAs）和肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens, TAAs）。

TSA是指肿瘤细胞有而正常细胞没有的抗原，而TAA是指二者都有但在肿瘤细胞中过表达的抗原。TSA和TAA很好地区分了肿瘤细胞和正常细胞，于是单克隆抗体疗法出现了。

早期的单抗都是鼠源或嵌合抗体，因此免疫原性就比较强，再加上抗体分子量较大，导致其肿瘤渗透率很差。后来抗体工程的发展解决了这些问题，但是单克隆抗体对肿瘤的治疗效果还是不尽如人意。

于是，人们将抗体的特异性和化疗药的毒性结合到一起，产生了抗体偶联药物（antibody-drug conjugates, ADCs）。ADC主要由三个部分组成：抗体、连接子和毒素。

早期的ADC利用肿瘤微环境的差异性（如特定的酶、pH等）来释放毒素，这种方式导致ADC产生较大的毒性。新型的ADC则是利用细胞的内化作用，转移到细胞内部再释放毒素，从而大大减少了毒性。

本文将带你系统地了解ADC的方方面面，以及它的最新研究动向。

ADC的结构图源：Biosci Rep. 2015 Jun 12;35(4):e00225

1、ADC作用机制

胃酸和蛋白酶会对ADC造成破坏，因此它只能通过静脉注射方式给药。ADC进入血液循环后随血液到达全身，当它与肿瘤细胞表面抗原结合后，就会发生内化作用，即细胞膜产生凹陷，最终向内生成一个小球，称内吞体（endosome）。

内吞体的外表面包裹着一层网格蛋白，内表面存在一些Fc受体（FcRns），由于H+的内流，内吞体内部形成酸性环境，促进ADC与FcRn的结合，这些与FcRn结合的ADC会被重新运输到细胞外，pH回到了7.4，这时二者又分离，释放出ADC。这一机制可以减少ADC对正常细胞的伤害，但同时也会影响其对肿瘤细胞的作用。FcRn主要表达于内皮细胞的内吞体中。

剩下那些没有结合FcRn的ADC最终保留在内吞体中，随着内吞体与溶酶体的融合，这些ADC被溶酶体中的各种酶降解，释放出毒素分子。这些毒素分子有的直接杀死肿瘤细胞，有的则通过诱导其凋亡将其消灭。此外，将靶细胞杀死后，毒素分子还能继续发挥作用，杀死相邻的肿瘤细胞以及肿瘤的支撑性组织。

ADC作用机制图源：Biosci Rep. 2015 Jun 12;35(4):e00225

从血液循环到最终释放毒素分子，每一步都会有ADC的损失，因此ADC只有达到一定的浓度，才能保证最后有足够量的毒素分子发生效应。

2、靶点选择

在设计一款ADC药物之前，得先确定靶点。靶点必须是肿瘤特异性的，或者在肿瘤中高表达的。吉妥单抗的失败就是因为它的靶点抗原CD33表达量过低。但是，光满足这一点还远远不够。它还得有足够的能力驱动内化作用，具有较高的表达量以及外显率。

肿瘤特异性抗原是最理想的靶点，但事实上大多数靶点都是肿瘤相关抗原，因此得保证它们在正常细胞中的表达量尽可能地低。

PSMA在正常前列腺细胞中只表达于细胞浆，而在前列腺癌细胞中则会暴露于细胞外；HER2在乳腺癌细胞中高表达，而在正常细胞中表达量很少。因此这两种抗原都可以作为ADC的靶点。

抗原驱动内化作用的能力取决于抗原的种类和毒素分子的种类。有些抗原不管有没有结合抗体，都会频繁地发生内化作用，但有些就一直待在细胞膜上不会动，而前者才可以将ADC带入细胞内。

除了抗原自身与其内化作用相关外，毒素种类也会影响抗原的内化作用。例如，CD20正常情况下不会诱导内化作用，当利妥昔单抗连接阿霉素/澳瑞他汀时，不发生内化，当连接卡奇霉素时又可以发生内化。

还有一种情况，当抗原在肿瘤细胞通路中发挥作用时，影响肿瘤细胞的正常生理功能，从而抑制肿瘤的生长。比如T-DM1中的曲妥珠单抗，在特异性结合HER2后可抑制细胞生长。

T-DM1作用机制图源：Clin Cancer Res. 2011 Oct 15;17(20):6437-6447

肿瘤相关靶点最常见的就是位于细胞表面的蛋白，事实上我们还可以把目光放到肿瘤细胞之外的附属组织，比如新生血管和细胞外基质组织，这些组织保证了肿瘤细胞的生长和扩散，因此，破坏这些组织可以间接地抑制肿瘤生长，典型的例子有成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein, FAP）和蛋白酪氨酸激酶7（protein tyrosinekinase 7, Ptk 7）。

3、单克隆抗体选择

抗体的任务是让ADC具有高靶标特异性、高靶标结合力以及在肿瘤部位的持久暴露。基于这些原则，我们选择的抗体：1）不能和正常细胞产生反应，2）活性要在纳摩尔或者皮摩尔级别，3）具有较长的半衰期，4）尽可能小的免疫原性。

ADC的靶标特异性差不仅导致对正常细胞产生毒性，还会因免疫原性加快血浆清除速度。免疫原性是影响血浆清除速度的主要因素。早期的ADC，其抗体都是鼠源或嵌合抗体，因此免疫原性很强，很快就会被清除，无法发挥作用，所以现在使用的抗体基本都是人源化的或者人源抗体。

抗体占ADC总质量的90%以上，抗体的大小决定了ADC的渗透性。血管内皮只有一层细胞，普通血管的分支较少，内皮细胞排列相对紧密，大分子无法透过，但肿瘤组织内的血管分支很多，内皮细胞排列疏松，像ADC这种大分子也可以轻松透过，因此可以较好地进入到肿瘤组织。

与此同时，要保证像肝、肠、皮肤等代谢性和清除性器官不能透过ADC，这样才能将ADC截留在血液循环中，增加其半衰期。除此之外还有一种因素会影响ADC的半衰期，那就是FcRn，ADC-FcRn复合物可以使ADC重新回到血液循环或者肿瘤组织间液中，再次利用。

单抗的作用机制有两种，一种是直接阻断肿瘤细胞的通路（如曲妥珠单抗），另一种则是通过激活免疫细胞来杀死肿瘤细胞，如ADCC、CDC、CDCC等。后者的最终效果很大程度上与抗体的亚型有关，但不管是哪种亚型，都存在各种问题。为此，人们开始设计双特异性抗体，例如卡妥索单抗可同时靶向肿瘤细胞的EpCAM抗原和T细胞的CD3抗原，从而促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

ADCC、CDC、CDCC机制图源：Biosci Rep. 2015 Jun 12;35(4):e00225

4、连接子

连接子的任务是保证ADC在血液循环中稳定不断裂，而在肿瘤组织中又能断裂释放出毒素分子。在设计连接子时需要考虑：1）连接子的可断裂性2）连接位点3）连接机制。

连接子大致分为可裂连接子和不可裂连接子两种。可裂连接子依赖肿瘤微环境的特异性来使ADC发生断裂。腙连接子利用溶酶体中较低的pH值，发生酸水解，从而释放毒素分子。二硫键连接子容易被谷胱甘肽分解，而肿瘤细胞中的谷胱甘肽含量较高。

还有一种是酶不稳定连接子（或肽连接子），它通过二肽将抗体与毒素分子连接，由于打破肽链的酶只在低pH环境下发挥作用，因此这种连接子不会在肿瘤之外的中性区域断裂。临床试验表明，与腙连接物相比，酶不稳定连接物具有更高的特异性、更高的稳定性和更长的半衰期，因此毒性相对更小。

与之不同的是，不可裂连接子依赖于内化后的溶酶体裂解作用。溶酶体中的蛋白酶分解单克隆抗体的蛋白质结构，最后留下一个氨基酸（通常是赖氨酸或半胱氨酸）仍然附着在连接体和细胞毒素上。由此产生的氨基酸-连接物-细胞毒素复合物释放到细胞质中，成为活性药物。

连接子确定后，还需要确定药物-抗体比率（DAR），按道理DAR值越高效果越好，但事实远非这么简单，过度的药物结合导致ADC容易发生聚集并被识别为外来蛋白，增加其清除率和免疫原性增加。研究表明，每个单抗负载2-4个毒素分子最为合适，在清除率和最大效力之间达到了最佳平衡。

不可裂连接子具有更好的稳定性，因此采用这类连接子的ADC半衰期更长，副作用风险降低，同时保留活性。但另一方面，可裂连接子可能产生一种旁观者效应（bystander effect）, 旁观者效应通常是由疏水性细胞毒素的细胞外流引起的，它可以从抗原阳性的靶细胞扩散进入相邻抗原阴性的健康细胞。

尽管旁观者效应破坏了ADC的靶向特异性，但在治疗缺乏靶抗原同质表达的实体瘤时，这种效应却是有利的。旁观者效应仅发生在可裂连接子，因为不可裂连接子分解形成的氨基酸-细胞毒素复合物带电，因此不能穿过靶细胞的疏水性脂质双层。

连接子的重要作用图源：Acta Pharmaceutica Sinica B, 2021, 2211-3835

5、偶联技术

传统的ADC偶联方法是将毒素分子直接与抗体连接，通过半胱氨酸的巯基（图A）或赖氨酸的氨基（图B）相连，它的缺点是连接位置和数量受限于抗体蛋白的序列。而且生产出来的ADC质量不一，有的抗体连接上了毒素而有的没连接上，除了影响疗效，没有连接毒素的抗体还会对抗原进行占位，进一步影响ADC发挥作用。

为此，人们在单抗的特定位置引入选择性反应分子，这样可以控制药物附着的部位和数量，并可能增加ADC的治疗窗口，同时降低毒性并改善药代动力学性质。这种策略主要有三种结合技术，分别是：1）通过未配对半胱氨酸残基接合2）通过谷氨酰胺转氨酶接合3）通过非天然氨基酸接合。

通过未配对半胱氨酸残基接合（图C）。这种方法依赖于定点突变，即在单克隆抗体的特定位点引入固定数量的半胱氨酸。这一过程保持了天然半胱氨酸残基之间的二硫键，同时避免了ADC异质性问题。

通过谷氨酰胺转氨酶接合（图D）。这种方法首先将单抗的特定位点修饰为谷氨酰胺，再利用谷氨酰胺转氨酶将含胺的细胞毒素结合到该位点上。它的主要优点是这种酶不识别原本的天然氨基酸，而是与谷氨酰胺标签序列相互作用，该标签序列可通过质粒并入单克隆抗体。由于单抗上可能的结合位点数量增加，这种技术可以更好地控制药物结合。

通过非天然氨基酸接合（图E）。非天然氨基酸在结构上与天然氨基酸非常相似，是利用基因密码子拓展技术，将含有一些生物正交官能团的非天然氨基酸引入到蛋白质中，然后在偶联药物，具有定点可控，操作方面，产品质量均一的优势，比如目前在临床三期的ARX788。

ADC的偶联技术图源：MAbs. 2014 Jan-Feb;6(1):46-53

6、毒素

ADC的毒素也需要满足很多特性。首先，由于ADC通常在水溶液中制备并经静脉给药，因此毒素分子需要有较好的稳定性。第二，毒素的活性最好能达到皮摩尔级别，即常规化疗药物的100–1000倍，因为最终只有一小部分ADC到达肿瘤细胞。第三，依赖溶酶体释放的毒素需要耐低pH，否则在到达效应部位之前就已失效。

目前细胞毒素大致分为澳瑞他汀、美登素、卡奇霉素，以及不太常用的duocarymycins和PBD二聚体。前两种都是通过干扰细胞周期来抑制细胞分裂，其中澳瑞他汀（如MMAE、MMAF）通过抑制微管蛋白上的GTP转化为GDP，导致微管的过度生长；美登素（如DM1、DM4）则是通过结合微管的生长端，阻止微管的成熟，最终影响细胞的分裂。

Auristatins和maytansines作用于微管蛋白图源：Biosci Rep. 2015 Jun 12;35(4):e00225

而卡奇霉素、duocarymycins和PBD二聚体则会导致DNA损伤。这些毒素分子最终都会诱导凋亡导致癌细胞死亡。

Calicheamicins损伤DNA的机制图源：Toxins (Basel). 2011 Jul;3(7):848-883

7、展望

历经几十年，ADC已经有了巨大的发展，但它依然面临着不小的挑战。一方面导致ADC疗效不够的因素很多，另一方面ADC对正常细胞的伤害依然无法完全避免。组成ADC的三个主要部件都会影响它的疗效和副作用，如何同时优化三者达到最佳效果，目前还是一个难题。

尽管在设计上存在挑战，ADC还是为癌症疗法提供了新的思路，并有望成为未来精准医疗的重要组成部分。

参考文献

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